大家好，今天跟大家分享一篇发表在J.Am.Chem.Soc.上的文章，文章题目是“MolecularIdentificationofTumor-DerivedExtracellularVesiclesUsingThermophoresis-MediatedDNAComputation”，本文的通讯作者是国家纳米科学中心的孙佳姝教授，医院第五医学中心的张少华副主任医师和上海交通大学医学院分子医学研究所的韩达研究员。孙佳姝教授的研究领域涉及分析化学，微流控生物技术，纳米生物医学。张少华副主任医师擅长乳腺癌化疗、内分泌治疗以及靶向治疗等方面。韩达研究员的研究方向主要为核酸纳米技术、纳米可控组装、生物分析传感技术、肿瘤的早期诊断与靶向治疗。本文提出了一种由热泳介导的DNA计算设备用于检测肿瘤衍生的细胞外囊泡(tEV)，该策略利用基于适配体的逻辑门，使用单个细胞外囊泡上的多个蛋白质生物标志物作为输入和热泳积累以放大输出信号，实现tEV的高灵敏度和特异性分析。

肿瘤衍生的细胞外囊泡(tEVs)在癌症的发生和发展中发挥着至关重要的作用，成为非侵入性癌症诊断的有前途的生物标志物。然而，tEV的灵敏和特异性检测受到EV表型异质性的挑战。例如，tEV和非肿瘤细胞外囊泡(EV)尽管表达水平略有不同，却可以在膜上具有相似的大小和相同的蛋白质标记。因此，对于目标tEV的精确识别，非常需要对单个EV上的多个生物标志物进行分析。DNA计算技术的快速发展为分析单个生物颗粒的分子模式提供了强大的工具，具有高灵敏度和特异性。然而，考虑到与细胞相比，EV蛋白标记的丰度低得多以及它们的尺寸更小，EV膜上的DNA计算实际上仍然具有挑战性。热泳是一种无标记技术，用于在温度梯度中精确操纵微米/纳米粒子，基于DNA的传感本质上由于具有出色的热稳定性可以与热泳兼容。

本文报告了一种热泳介导的DNA计算方法，用于通过特异性和灵敏地检测tEVs来诊断和诊断乳腺癌(BC)的分子表型。选择两种BC相关蛋白，上皮细胞粘附分子(EpCAM)和人表皮生长因子受体2(HER2)作为EV膜上逻辑门激活的输入。在单个EV上对EpCAM和HER2进行双重检测可以改善与BC密切相关的tEV的识别。为此，设计了两条ssDNA链(Apt-S-T)，每条链由适体序列(Apt)、间隔序列(S)和关联的立足点激活序列(T)组成。在Apt-S-T探针与EV膜上的目标蛋白结合后，在连接器序列(Connector)的帮助下形成了一个关联的立足点纳米结构，用于与门操作。然后使用H1和H2发夹探针启动脚趾激活的HCR以进行信号放大。为了提高DNA计算的灵敏度，EVs首先被CD63适配体修饰的微珠捕获。在HCR之后，微珠通过热泳操作富集以放大输出信号。

作者首先测试了DNA计算中的三个组件（Apt-S-T、连接器以及H1和H2探针）是否可以自主级联以进行逻辑操作。结果显示，Cy5/BHQ3标记的H1和H2探针（L1）在缓冲液中的孵育不会导致HCR组装的形成。在添加ssDNA引发剂(L2)或EpCAM-S-T1、HER2-S-T2和连接器(L3)后，观察到荧光强度增加，这是由关联的立足点触发的HCR引起的。相反，在没有连接器(L4)或一个Apt-S-T探针(L5)的情况下，没有检测到HCR产物。接着，这种验证了DNA计算在细胞膜上的性能。三种人乳腺癌细胞系（BT-与HER2+、EpCAM+表达模式；MCF-7与HER2-、EpCAM+和UACC-与HER2+、EpCAM-）和一种人乳腺上皮细胞系（MCF-10A与HER2-，EpCAM-)进行了研究。通过流式细胞术分析和荧光共定位测量证实了HER2和EpCAM在不同细胞系及其分泌的EV上的表达模式。为了激活细胞膜上基于DNA的AND门，作者将EpCAM-S-T1和HER2-S-T2探针与细胞在4°C下孵育1小时。未结合的探针被洗掉，然后将细胞与连接器、H1和H2探针一起孵育1.5小时。在细胞膜上进行DNA计算后，共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)分析显示，BT-细胞的荧光强度比MCF-7细胞、UACC-细胞或MCF-10A细胞分别高23.9，18.4，34.2倍。

作者接下来继续在EV膜上进行DNA计算。扫描电子显微镜(SEM)分析证明，每个适配体修饰的微珠上固定的EV平均数量为个。透射电子显微镜(TEM)图像显示EV周围存在电晕，这是由于在EV膜上进行DNA计算后形成了HCR组件。为了进一步放大与门的输出信号，在优化的实验条件下，通过热泳和热对流的相互作用，将EV共轭微珠固定并转移到去离子水中进行富集。结果显示，BT-EV（HER2+，EpCAM+）在微珠上的热泳积累导致荧光信号显着增加，而与MCF-7EV（HER2-，EpCAM+），UACC-EV（HER2+、EpCAM-）或MCF-10AEV（HER2-、EpCAM-）缀合的微珠没有观察到明显的增强。

在展示了热泳介导的DNA计算对EV膜的有效性后，作者将这种方法应用于临床中的BC诊断和分子表型分析（BC患者n=20，健康供体(HD)为n=10）。在通过纳米粒子跟踪分析对浓度进行量化后，使用从HER2+BC患者的血清样本（3.6μL）中分离出的EV来评估该方法的灵敏度。由于EpCAM是一种泛癌标志物，来自HER2+BC患者的tEVs也可以在膜上过度表达EpCAM。使用血清EV作为基于DNA的AND门的输入，热泳扩增后的输出信号显示出相对于EV浓度从2×到2×μL-1的线性增加。检测限确定为2.8×μL–1，比流式细胞术（4.6×μL–1）低3个数量级。本文提出的热泳介导的DNA计算可以有效地将BC患者（HER2+/–，EpCAM+）与HD（HER2–，EpCAM-）区分开来。值得注意的是，与来自HER2-BC患者（n=8，p=0.）的输出信号相比，来自HER2+BC患者（n=12）的输出信号显着升高，这表明DNA逻辑操作对癌症患者的分子表型分析具有潜力。接受者操作特征(ROC)分析显示BC与HD的可靠区分（曲线下面积(AUC)=0.99）。进一步分析表明，BC与HD和HER2+BC与HER2–BC的分类准确度分别为97%和90%。对于BC与HD分类，假阳性率为0%，假阴性率为5%。对于HER2+与HER2–的区分，假阳性率为25%，假阴性率为0%。

总之，本文通过整合立足点引发的HCR和热泳富集，证明了EV膜上的DNA逻辑计算。热泳介导的DNA逻辑装置能够特异性和灵敏地识别由双肿瘤生物标志物（HER2和EpCAM）表达模式定义的tEV。将该方法应用于临床血清样本中的EV，实现了对HER2+BC、HER2–BC和HD的准确区分，这优于之前单独检测EV上的HER2或EpCAM以进行BC诊断的研究。而且，热泳介导的DNA计算可以通过使用针对EV上肿瘤相关蛋白标志物的不同适体适用于不同的肿瘤类型。

DOI:10.1/jacs.0c

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